1 概述

 测定细菌在体外抗菌药物敏感性（以下称药敏试验）的试验方法很多。绝大多数实验室采用以琼脂扩散法作为常规方法测定常见的快速生长的病原菌。本文简单介绍了一下标准纸片扩散法的操作规程，并根据实践提出一系列建议有助于药敏试验的标准化。

2药敏试验目的

2.1 测定鸡病变部位分离细菌对抗生素类药物的敏感性，为临床预防治疗鸡细菌感染选择敏感药物。

2.2 测定抗生素类药物对本地区分离流行菌株的敏感性，监督检测药品抑菌和杀菌效果。

2.3 标准药敏片进行抗生素作用效果流行病学调查，了解本区域细菌耐药变迁情况。

3试验需要仪器、试剂材料

3.1 Mueller-Hinton琼脂

    在现有的许多培养基中，我们认为Mueller-Hinton琼脂最适合于常规敏感试验，理由是：（1）产品批间试验结果重复性好；（2）磺胺、甲氧苄氨嘧啶、四环素的抑制物含量低；（3）绝大多数致病菌生长较好；（4）大量有关敏感试验的数据是由此培养基得出的。尽管Mueller-Hinton琼脂通常是可靠的，但是偶然产品也有批间差。如果一批培养基不能很好地保证细菌生长，抑菌环则增大，超出质控范围，造成错误结果。只有按NCCLS M6-P做过试验并符合规定的培养基才能使用。

3.2 药敏纸片

  药敏纸片应注意保存在干燥环境。按下法保存：（1）在8℃以下保存，或－14℃以下冷冻保存。β－内酰胺类药的纸片应密封冷冻保存，仅取少量作为日常使用，在冰箱里保存约一周。有些不稳定的抗生素（如头孢拉定、棒酸合剂）须冷冻保存，用时取出；（2）纸片应在使用前1－2小时从冰箱取出，暖至室温再打开，以避免出现冷凝水；（3）纸片启封后应放入可密封的有干燥剂的容器中；（4）纸片只能在有效期内使用，过期应弃去。

3.3试验仪器设备 

恒温培养箱、电子天平、镊子、新华1号定性滤纸、广口瓶、量筒

4 操作步骤

4.1 制备接种菌液

4.1.1 增菌法 

步骤如下：（1）选琼脂平板上形态相同的菌落至少4－5个，用接种环挑其顶部，移至4－5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中；（2）置培养箱37℃培养16h，浓度约1－2×10⁸CFU/ml；（3）用生理盐水或肉汤校正菌液浓度，与比浊管相同。可用光电比浊。目测比浊须在适当光照下以黑色线条为反衬。

4.1.2 直接菌悬液法 

步骤如下：（1）做常规药敏试验，可直接用过夜培养的菌落（必须用无选择性培养基平板，如普通琼脂培养基）在盐水或肉汤中制备接种菌液。菌液浓度调至0.5麦氏管；(2)此法适用于在肉汤培养基中生长不好的细菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和链球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐药试验；（3）当用此法做复方磺胺药的试验时，从平板上直接挑菌落时会携带相当量的拮抗剂，造成敏感菌株的抑菌环内出现轻微的生长菌膜。

4.2 接种平板 

步骤如下：（1）校正的菌液须在15分钟内使用。用一无菌棉试子蘸取菌液并在上端管壁旋转挤压几次，去掉过多的菌液；（2）用试子涂布整个琼脂平板表面，反复涂布几次，每次将平皿旋转60度，保证涂布均匀。（3）将平皿盖打开3－5分钟，使培养基表面的水份吸收掉。然后贴药敏纸片；（4）注意：避免用过浓的菌液，禁用未经稀释菌或其他不标准菌液接种平板。

4.3  贴纸片 

步骤如下：（1）接种平板后，贴上药敏纸片。用镊子或针尖压一下纸片使其与培养基表面贴牢。纸片要贴得均匀，纸片与纸片中心距离不得小于24mm。原则上，直径150mm得平板贴12张纸片，直径100mm平板贴5张纸片。纸片贴后不应再移动，因为有些药物会立即扩散；（2）贴上纸片15分钟内，须把平板倒放在35℃恒温箱中。因为抑菌环解释标准是在普通环境中标定的，所以除嗜血杆菌和淋病奈瑟氏菌外，平板不可放在高CO₂的环境中。CO₂与某些因素作用可使抑菌环增大。

4.4  读取结果 

（1）经16－18小时培养后，观察结果。菌液浓度适合且涂得好，抑菌环规则，细菌呈融合生长。如果出现单个菌落，说明接种量小，需重做试验，测量抑菌环直径须包含纸片直径：手持平皿从背面目测检查每快平板，借反射光（黑色无放光背景），用卡尺、普通尺或特制的模板量取抑菌环直径，单位为毫米。培养基中如果加了血液，须打开平皿盖，借反射光，从正面量抑菌环。如果是葡萄球菌或肠球菌，须培养24小时后，经检查苯唑青霉素和万古霉素的抑菌环内有无耐药菌株的生长。抑菌环内有任何生长的表现都表明是耐药菌株。

（2）肉眼见不到细菌明显生长的区域为抑菌环边缘，有很难辨认的细小菌落不算。如抑菌环内有大量细菌生长，须再移植出来，重新鉴定，重新做药敏试验。变形菌在某些抗菌药物纸片周围可弥漫生长到抑菌的区域内，当抑菌环边缘清楚，弥漫生长不算。甲氧苄氨嘧啶和磺胺药的拮抗剂会支持细菌生长，因而测这类药时可忽略轻微生长（80％以上受抑制），以浓密生长的区域作为抑菌环的界限。用加血的培养基测链球菌，测量抑菌环时不包括溶血环。

5结果解释

5.1 敏感度分级

5.2现场临床用药注意事项

    临床口服给药，除了考虑细菌对药品的敏感性，还须考虑药物是否经肠道吸收及药品吸收后的分布、代谢情况。

6 药敏试验方法的局限性

6.1  对各类细菌的适用性  

   本文介绍纸片方法是由快速生长的致病菌标定的，菌株包括肠杆菌科、葡萄球菌、肠球菌、绿脓假单胞菌、不动杆菌。经适当改动可用来测定嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和链球菌。对那些未在表中列出的细菌，如使用的培养基不同、孵育环境不同或生长率不同等，尚没有重复性好的标准方法。这类细菌的实验结果不易解释，不应用纸片法测定。

6.2  易引起误导的结果 

    当用某些抗生素测试某特定细菌时，可能出现严重的误导，主要包括以下几种情况（但不限于这几种）：第一、第二代头孢菌素和氨基糖苷类测沙门氏菌和志贺氏菌；所有β－内酰胺类抗生素（除了苯唑西林、甲氧西林和乙氧西林）测耐甲氧西林葡萄球菌；头孢菌素、氨基糖苷类（除了高水平耐药试验）、林可霉素和甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异恶唑测肠球菌；头孢菌素测李斯特菌。

6.3  出现抗药性  

    长期使用某些抗生素治疗，可出现抗药性。所以，开始敏感的菌株可能在开始治疗3到4天内便耐药。肠杆菌、枸橼酸杆菌和沙雷氏菌对三代头孢菌素，铜绿假单胞菌对所有抗生素，葡萄球菌对喹诺酮类常出现这种情况。

6.4  质量保证措施  

    须用本标准介绍的质量保证方法监测各种试验参数。质控结果合格并不能保证每个病人的结果都准确。当病人分离菌株有非典型或不一致结果时，应重复试验和重鉴定，以确保结果准确。每个实验室应该制定相应的措施

6.5被测菌株生长不好的解决办法

    只有能够在未强化的Mueller-Hinton琼脂培养基上生长良好的须氧菌或兼性厌氧菌才能在此培养基上做药敏试验。某些娇嫩细菌，如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌、β溶血链球菌在未强化的Mueller-Hinton琼脂培养基上生长不良。这类细菌，药敏试验需用经强化或另外的专用选择性培养基。

7总结

    只根据是否出现抑菌环而不考虑其大小来判断细菌对抗菌药物敏感性的试验方法，结果是不准确的。纸片扩散法试验必须遵循标准的方法学原理，并根据抑菌环与最低抑菌浓度的相关性，并结合临床上已知敏感或耐药菌株的状况进行标准化，结果才能可靠。纸片法抗菌药物敏感试验结果对现场临床用药是个参考。